液質(zhì)聯(lián)用法在皂苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物分析中的研究
皂苷是許多中草藥如人參、遠(yuǎn)志、桔梗、甘草、知母和柴胡等的主要有效成分之一,藥理研究表明皂苷類成分具有抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝及免疫、治療心血管疾病和糖尿病等的生物活性。采用現(xiàn)代化學(xué),藥理學(xué),生物學(xué),醫(yī)學(xué),生物信息學(xué)等多學(xué)科研究方法,對(duì)常用中藥及復(fù)方進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分,體內(nèi)過(guò)程,配伍規(guī)律,作用機(jī)制等研究,闡明藥效物質(zhì)和作用機(jī)理;將中藥有效物質(zhì)及其配伍研制成為療效確切,安全性高,有效成分清楚,作用機(jī)理明確,質(zhì)量可控,劑型先進(jìn),服用方便的現(xiàn)代中藥;同時(shí)探討有效成分的生源途徑和生物合成。詮釋中醫(yī)藥理論,創(chuàng)制現(xiàn)代中藥,促進(jìn)中藥現(xiàn)代化和國(guó)際化。
采用色譜-質(zhì)譜連用法進(jìn)行皂苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物分析,為闡明中藥的治病機(jī)制提供有利的證據(jù)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)技術(shù)是一項(xiàng)集高效液相色譜HPLC的高分離性能與串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度、高專屬性優(yōu)點(diǎn)于一身的生物分析技術(shù),它不需要分析物之間實(shí)現(xiàn)完全的色譜分離,其多窗口檢測(cè)功能允許同時(shí)對(duì)多個(gè)成分進(jìn)行定量分析。
中草藥及其方劑成分復(fù)雜,HPLC與UV或DAD檢測(cè)器相聯(lián)接,對(duì)于單個(gè)色譜峰僅能提供保留時(shí)間及紫外吸收等信號(hào),而對(duì)未知成分所能提供的結(jié)構(gòu)信息相當(dāng)有限。色譜峰的指認(rèn)必須有對(duì)照品,而大多數(shù)中藥化學(xué)成分的對(duì)照品很難獲得,而對(duì)于體內(nèi)中藥藥物分析,一般的檢測(cè)技術(shù)也難以滿足給藥后血藥濃度的測(cè)定要求。
HPLC/MS的應(yīng)用可以集HPLC的高分離效能與串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度、高專屬性的優(yōu)點(diǎn)于一體,,并能夠給出被測(cè)組分的分子量信息,通過(guò)多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析,還可以得出被測(cè)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。
1、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行人血液中偽人參皂苷代謝產(chǎn)物分析
建立液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血漿中偽人參皂苷GQ濃度。在血漿樣品中加入適量?jī)?nèi)標(biāo),以乙酸乙酯萃取后采用Waters Xevo TQSLC-MS/MS進(jìn)行分析。采用Poroshell 120 EC C8色譜柱(2.1 mm×50 mm,2.7μm),柱溫40℃,以甲醇-10 mmol·L-1醋酸銨水溶液(80∶20)為流動(dòng)相,流速0.3 mL·min-1;采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)的掃描模式,以電噴霧離子源(ESI)在負(fù)離子電離模式下進(jìn)行測(cè)定。
該方法的線性范圍為2.500~5000 ng·m L-1,最低定量限為2.500 ng·m L-1,日內(nèi)、日間精密度均小于15%,準(zhǔn)確度在85%~115%之間,萃取回收率約9%~11%,基質(zhì)效應(yīng)約66%~73%,穩(wěn)定性考察結(jié)果良好。藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明,靜注偽人參皂苷GQ 120 mg·次-1,每日1次,連續(xù)用藥5 d后,達(dá)峰時(shí)間為2 h,半衰期約10 h。試驗(yàn)第1 d和第5 d主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)基本一致,計(jì)算蓄積系數(shù)分別是RC max=0.964±0.099,和RAUC=0.965±0.181,兩者均接近1。
該方法適用于偽人參皂苷GQ的人體藥代動(dòng)力學(xué)研究。在此給藥方案下,偽人參皂苷GQ在人體內(nèi)沒(méi)有明顯蓄積現(xiàn)象,連續(xù)給藥不影響偽人參皂苷GQ的人體藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程。
2、LC-MS/MS進(jìn)行大鼠血液中丫蕊花皂苷代謝產(chǎn)物分析
采用高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測(cè)定大鼠血漿中丫蕊花皂苷G的含量,并研究其在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征。方法采用Phenomenex Luna C18色譜柱(150 mm×2 mm,3μm),流動(dòng)相為乙腈-水(含0.1%甲酸),流速0.2 mL·min~(-1),以人參皂苷Rg3為內(nèi)標(biāo);分別于大鼠尾靜脈注射丫蕊花皂苷G 0.25、0.5、1 mg·kg-1,給藥后于不同時(shí)間點(diǎn)采血,經(jīng)固相萃取法處理后,采用上述LC-MS/MS法測(cè)定血藥濃度;采用DAS 3.0軟件、非房室模型擬合藥代參數(shù)。結(jié)果 0.01~1.0μg·m L-1丫蕊花皂苷G與峰面積的線性關(guān)系良好,方法學(xué)考察均符合要求;大鼠靜脈給藥后的血漿藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為:t1/2=3.447±0.898 h、MRT0-∞=4.568±1.075 h、CL=0.858±0.171L·h-1·kg,AUC、Cmax隨給藥劑量的增加而等比增大,符合線性藥動(dòng)學(xué)特征。此方法簡(jiǎn)便、靈敏,結(jié)果準(zhǔn)確,適用于大鼠血漿中丫蕊花皂苷G的含量測(cè)定及其藥動(dòng)學(xué)研究。
也有研究者采用HPLC-ESI-MS/MS方法對(duì)血塞通注射液中皂苷進(jìn)行定性定量分析。還有研究者采用加壓溶液萃取法(PLE)與HPLC-DAD-MS技術(shù)測(cè)定人參葉和人參中9種皂苷及2種聚乙炔醇類化合物(人參環(huán)氧炔醇,人參醇),這是一種快速檢測(cè)中藥的方法,對(duì)于控制人參的質(zhì)量很有幫助。
建立可靠的分析方法是進(jìn)行藥物體內(nèi)代謝產(chǎn)物分析的前體,隨著現(xiàn)代色譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展,體內(nèi)多微量代謝產(chǎn)物的分離、鑒定已經(jīng)成為了一個(gè)連續(xù)過(guò)程。尤其是LC-MS樣品前處理簡(jiǎn)單,一般不要求水解或衍生化處理,運(yùn)用LC-MS技術(shù)不僅可以避免復(fù)雜繁瑣的分離、純化代謝產(chǎn)物的工作,而且可以分離鑒定難以辨識(shí)的體內(nèi)痕量代謝產(chǎn)物。
[來(lái)源:儀器信息網(wǎng)]